煙霧吸入誘發(fā)急性呼吸窘迫綜合征大動(dòng)物模型

背景：急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是多因素的，可由膿毒癥、創(chuàng )傷或肺炎等原發(fā)性疾病引起。它是危重病人死亡的主要原因之一，據報道死亡率高達45%。本研究的重點(diǎn)是建立煙霧吸入誘導ARDS的大型動(dòng)物模型，以期為科學(xué)界提供可靠、可重復的孤立性毒性吸入損傷誘導的ARDS大型動(dòng)物模型。方法：全身麻醉下在超聲引導下放置頸動(dòng)脈、肺動(dòng)脈和股動(dòng)脈導管后，動(dòng)物（n = 21）暴露于煙霧中 1 至 2 小時(shí)。在整個(gè)過(guò)程中監測外周血氧飽和度（SpO2）、生命體征和呼吸參數。在煙霧暴露之前、期間和之后采集胸部x光片、頸動(dòng)脈、股動(dòng)脈和肺動(dòng)脈血樣。吸入煙霧48小時(shí)后，對動(dòng)物實(shí)施安樂(lè )并收集肺組織進(jìn)行分析。結果：吸入煙霧48小時(shí)后，動(dòng)物出現ARDS，表現為SpO2下降約31%，PaO2/FiO2比率下降約208（50%），胸部x光檢查出現雙側彌漫性浸潤。結論：這項研究報道了一種新大動(dòng)物模型，該模型不存在諸如皮膚燒傷等混雜變量，可用于獨立性煙霧吸入誘導ARDS。使用這種*的模型可能有助于研究吸入性損傷的病理生理學(xué)或開(kāi)發(fā)新的治療方法。

簡(jiǎn)介：急性呼吸窘迫綜合征 (ARDS) 是危重患者的嚴重肺部疾病，據報道死亡率為 30-45%。 自 1994 年以來(lái)，死亡率沒(méi)有顯著(zhù)變化。 ARDS 可由多種肺部直接和間接損傷引起，包括敗血癥、外傷、肺炎和煙霧吸入/燒傷。 了解ARDS的病理生理學(xué)和分子機制對于開(kāi)發(fā)新的ARDS治療策略至關(guān)重要。柏林標準基于PaO2/FiO2（動(dòng)脈氧分壓/吸入氧分數）比值、呼氣末正壓（PEEP）水平、胸部x光片上雙側肺浸潤的發(fā)展以及已知臨床損傷一周內正常的肺毛細血管楔壓（PCWP）對ARDS進(jìn)行分類(lèi)。據報道，ARDS 中的肺損傷經(jīng)歷三個(gè)病理生理階段：滲出期涉及肺泡上皮損傷，導致肺通透性增加；增殖期包括Ⅱ型細胞增殖、上皮細胞再生、成纖維細胞反應和重塑；以及不可逆的纖維化期，包括肺中的膠原沉積。為了了解ARDS的發(fā)展，能夠模擬這些病理生理階段的可靠動(dòng)物模型至關(guān)重要。先前的研究使用小鼠模型評估 ARDS 受控誘導后的肺氣體交換和呼吸生理學(xué)。然而，這些小鼠模型在誘導機械通氣和采集血樣方面存在局限性，因此不適用于模擬 ARDS 臨床表現所必需的長(cháng)期研究。據報道，大型動(dòng)物模型在 ARDS 研究中顯示出更好的轉化潛力。 由于在解剖學(xué)、遺傳學(xué)和生理學(xué)方面與人類(lèi)相似，豬模型被認為是肺部病理學(xué)的優(yōu)秀模型。 各種研究使用豬模型來(lái)研究肺發(fā)育、急性肺損傷 (ALI)/ARDS 和其他疾病。煙霧吸入是燒傷后發(fā)生ARDS的主要原因之一，死亡率約為30-90%。有幾種大型動(dòng)物模型可用于煙霧/燒傷誘導的ARDS。然而，目前還沒(méi)有合適的大動(dòng)物模型可用于研究孤立性煙霧吸入誘導的ARDS，而不存在諸如皮膚燒傷等混雜變量。煙霧吸入性損傷后ARDS的發(fā)生率因患者而異，并取決于多個(gè)變量，如顆粒物濃度、一氧化碳濃度、煙霧中的揮發(fā)性化合物等。煙霧吸入性損傷是導致室內火災中人類(lèi)急性肺損傷/ARDS的主要損傷；皮膚燒傷的存在/不存在在患者的整體病理生理學(xué)中起著(zhù)附加作用，這使該患者群體的醫療和外科治療變得非常復雜。

動(dòng)物：母豬 (約50 kg, n?=?21)據我們所知，與公豬相比，母豬對ARDS的易感性并不高。我們的研究合作者先前僅使用母豬通過(guò)氣管內脂多糖開(kāi)發(fā)了嚴重ARDS的豬模型，在當前研究中使用母豬部分原因是通過(guò)對比肺損傷評估其模型的可靠性和再現性。

煙霧輸送系統：完成所有外科手術(shù)后，將動(dòng)物暴露于定制煙霧發(fā)生器產(chǎn)生的橡木煙霧中，該煙霧發(fā)生器與氣管插管并聯(lián)。煙霧輸送系統的示意圖如圖1所示。

外科手術(shù)：肌肉注射替拉唑（4.4 mg/kg）、氯酮（2.2 mg/kg）和甲苯噻嗪（2.2 mg/kg）的混合物來(lái)對動(dòng)物進(jìn)行誘導麻醉，根據需要靜脈推注芬尼（0.05 mg/kg）和/或異丙酚（2-4.4 mg/kg），后實(shí)施外周靜脈導管（PIV）放置和氣管內插管。在吸入煙霧之前以及吸入煙霧后24和48小時(shí)拍攝胸部x光片。將氣管插管插入氣管，以 6 mL/kg 的潮氣量 (TV) 和 5 cmH2O 的 PEEP 對動(dòng)物進(jìn)行通氣。調整呼吸頻率（RR）以維持潮氣末二氧化碳（ETCO2）監測的正常呼吸。在外科手術(shù)（中心靜脈和動(dòng)脈導管放置）期間，吸入氧的分數 (FiO2) 設置為 50%，然后滴定至 21% 并在整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中保持不變。在手術(shù)過(guò)程中，使用50%的FiO2減輕動(dòng)物的應激，持續30-40分鐘。非侵入性監測包括通過(guò)放置在動(dòng)物后腿周?chē)男鋷y量血壓、通過(guò)Surgivet監護儀記錄的外周血氧飽和度（SpO2）、心率（HR）和ETCO2。通過(guò)直腸探頭監測核心溫度，并使用循環(huán)加熱毯來(lái)防止身體冷卻。使用無(wú)菌技術(shù)和超聲引導，放置頸動(dòng)脈（CA）和股動(dòng)脈（FA）導管，用于連續實(shí)驗室抽血和有創(chuàng )血壓監測。 在超聲引導下，將肺動(dòng)脈導管置入頸內靜脈。CA和PA接入端口分別通過(guò)傳感器連接至Surgivet監視器和Vigilance II監視器。在整個(gè)研究過(guò)程中監測有創(chuàng )動(dòng)脈血壓、中心靜脈壓（CVP）、肺動(dòng)脈壓（PAP）、心輸出量（CO）、混合靜脈血氧飽和度（SmvO2）和中心（核心）溫度。從CA、FA和PA導管中抽取血樣。對存活手術(shù)中的鎮靜/麻醉動(dòng)物進(jìn)行持續監測，直到恢復胸骨臥位。完成吸入煙霧后，移除所有導管。 在吸入煙霧后 48 小時(shí)重復外科手術(shù)操作。

煙霧吸入：完成外科手術(shù)后，SI 組的動(dòng)物通過(guò)氣管插管接觸來(lái)自定制煙霧室的橡木煙霧。 從 0 小時(shí)時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始，煙霧暴露的持續時(shí)間為 1 至 2 小時(shí)。 煙霧是在室溫下以受控方式產(chǎn)生的。本研究中未測量煙霧密度/顆粒負荷。吸入的煙霧量約為每小時(shí)500升。在實(shí)驗過(guò)程中持續監測有創(chuàng )和無(wú)創(chuàng )參數。接觸煙霧后，從動(dòng)脈端口和 PAC 收集血樣。持續監測動(dòng)物直至從全身麻醉中恢復。 如果動(dòng)物出現血流動(dòng)力學(xué)不穩定（通過(guò)低血壓（收縮壓低于 60）和不可逆的去飽和度決定），則立即停止煙霧接觸。

通氣參數：在吸入煙霧當天，呼機參數保持在以下值：潮氣量，6 mL/kg = 270-360L/min； 呼吸頻率，18-30次/分鐘； PEEP 5 毫米汞柱； 和 FiO2，21–34%。 在煙霧吸入損傷后的 48 小時(shí)內，將動(dòng)物拔管并保持在室內空氣中。在煙霧吸入性損傷后48小時(shí)，再次將動(dòng)物置于呼機上，重復導管放置的手術(shù)程序，完成系列實(shí)驗室、成像和BAL取樣，并根據IACUC協(xié)議對動(dòng)物進(jìn)行人道安樂(lè )。在研究的最后一天，呼機參數與吸入煙霧當天相似，只是將 PEEP 保持在 0。

術(shù)后動(dòng)物監測和護理：從手術(shù)麻醉中恢復后，將所有動(dòng)物轉移到術(shù)后恢復圍欄，并由經(jīng)過(guò)培訓的人員每天24小時(shí)對其進(jìn)行監測。在最終煙霧暴露后24小時(shí)和48小時(shí)，進(jìn)行胸部x光檢查并抽取血樣進(jìn)行ABG分析。

支氣管肺泡灌洗 (BAL)：在一組6只插管動(dòng)物中，使用支氣管鏡在基線(xiàn)、2小時(shí)和48小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行豬肺BAL。通過(guò)支氣管鏡向二級和三級支氣管注入10ml無(wú)菌生理鹽水，并收集5毫升液體進(jìn)行分析。BAL液體樣品在4°C下以400g離心10分鐘，上清液儲存在? 80°C，直到分析。

結果：研究分為兩個(gè)階段。研究的第一階段旨在確定ARDS發(fā)生所需的最佳煙霧暴露時(shí)間。如圖 2 中的流程圖所示，根據煙霧吸入時(shí)間對動(dòng)物進(jìn)行劃分。 吸入煙霧 1 小時(shí)為“SI 1 h"（n = 3），吸入煙霧 2 小時(shí)為“SI 2 h" "（n = 18）。15 只動(dòng)物成功完成煙霧吸入 (SI) 實(shí)驗并在接觸煙霧后 48 小時(shí)存活，6 只動(dòng)物在手術(shù)過(guò)程中因麻醉/手術(shù)并發(fā)癥或煙霧吸入相關(guān)并發(fā)癥死亡。

煙霧吸入降低大動(dòng)物模型外周血氧合：在煙霧吸入實(shí)驗當天以及煙霧吸入后24小時(shí)和48小時(shí)連續測量SpO2水平。吸入煙霧1小時(shí)或2小時(shí)后，兩組的SpO2水平約為95%，并在吸入煙霧后24小時(shí)開(kāi)始下降。然而，與基線(xiàn) (98 ± 2%) 和 SI 1 h 組相比，SI 2 h 組的 SpO2 水平在吸煙后 48 小時(shí) (68 ± 6%) 顯著(zhù)下降。與SI 1h組的10%相比，SI 2h組的δSpO2（ΔSpO2）值降低了約30%。此外，與基線(xiàn)值和SI 1h組相比，在煙霧暴露48小時(shí)后，SI 2h組的PaO2/FiO2比率約降低至193.4。這些結果表明，在暴露于煙霧后 48 小時(shí)，吸入煙霧 2 小時(shí)的動(dòng)物表現出呼吸窘迫的跡象，表現為 SpO2 值下降到 68% 以下，并表明肺有損傷。在剩下的研究中，我們集中在煙霧暴露持續時(shí)間的2小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，并重復實(shí)驗以確保該模型的再現性。將動(dòng)物暴露于煙霧中2小時(shí)，為“SI"動(dòng)物。我們觀(guān)察到與基線(xiàn)值相比，SpO2下降了22–40%。此外，與相應的基線(xiàn)值相比，動(dòng)脈和混合靜脈血氧飽和度（SaO2和SmvO2）降低了約39–43%。

煙霧吸入誘發(fā)低氧血癥的大動(dòng)物模型：在整個(gè)研究過(guò)程中，從動(dòng)脈和混合靜脈血樣本中測量了動(dòng)脈血氣 (ABG)。動(dòng)脈氧分壓（PaO2）水平在煙霧暴露后1小時(shí)開(kāi)始下降，并在煙霧暴露后48小時(shí)從基線(xiàn)值95 mmHg顯著(zhù)下降至43 mmHg。正如預期的那樣，二氧化碳分壓 (PaCO2) 水平升高，ΔPaCO2 值與基線(xiàn)值相比增加了 27.5 ± 2.34 mmHg。吸入煙霧后 48 小時(shí)，pH 值也顯著(zhù)降低，HCO3 水平?jīng)]有顯著(zhù)變化。與吸入煙霧后的PaCO2值升高一致，潮氣末CO2（ETCO2）——測量氣管插管呼出的CO2濃度——從基線(xiàn)值33.9 ?±?12.8 mmHg顯著(zhù)增加至吸入煙霧48小時(shí)后的52.63 ?±? 13.5 mmHg。

先前的研究記錄了 PaO2/FiO2 比值以評估動(dòng)物模型中的低氧血癥水平。還證明，在煙霧暴露48小時(shí)后，PaO2/FiO2比率顯著(zhù)降低（198.87?±?37.13），其中40%的動(dòng)物的值小于170?；€(xiàn)和煙霧暴露后48小時(shí)ΔPaO2/FiO2值之間的差值約為208。此外，與基線(xiàn)相比，吸入煙霧48小時(shí)后紅細胞壓積（Hct）、血紅蛋白（Hb）和氧合血紅蛋白分數（FO2Hb）值降低。與相應的基線(xiàn)值相比，吸入煙霧后 48 小時(shí)，血液的總動(dòng)脈氧含量 (CaO2) 和混合靜脈氧含量 (CmvO2) 也顯著(zhù)降低。心率（HR）、體溫（Temp）、平均動(dòng)脈壓（MAP）和肺動(dòng)脈壓（PAP）無(wú)明顯變化。

煙霧吸入對肺實(shí)質(zhì)的影響：據報道，吸入煙霧會(huì )增加毛細血管滲漏。與先前的研究一致，我們在煙霧損傷后48小時(shí)，通過(guò)胸部x光片對肺損傷進(jìn)行反復放射學(xué)評估，觀(guān)察到彌漫性雙側浸潤。相比之下，吸入煙霧前拍攝的胸部x光片顯示兩個(gè)肺都正常。與對照動(dòng)物組相比，煙霧暴露48小時(shí)后肺組織的組織學(xué)檢查顯示白細胞浸潤、肺泡內出血和肺泡水腫的數量增加。與對照動(dòng)物相比，煙霧暴露 48 小時(shí)后肺組織的平均濕干重 (W/D) 比有所增加。在兩個(gè)對照組和兩個(gè)煙霧吸入動(dòng)物的石蠟包埋肺組織切片中進(jìn)行Ki67免疫組織化學(xué)。與對照組動(dòng)物相比，吸入煙霧后48小時(shí)的動(dòng)物肺組織切片顯示增殖細胞數量在統計學(xué)上顯著(zhù)減少。，從6只動(dòng)物采集的BAL液樣本顯示，與基線(xiàn)相比吸入煙霧48小時(shí)后BAL液的總蛋白濃度顯著(zhù)增加。

煙霧吸入對IL-6表達水平的影響：與基線(xiàn)水平相比，暴露于煙霧后48小時(shí)，BAL液樣本中的IL-6水平顯著(zhù)升高，2小時(shí)時(shí)略有升高。10只動(dòng)物血漿樣本中的IL-6免疫分析也表明，吸入煙霧2小時(shí)后，SI動(dòng)物的IL-6水平較基線(xiàn)顯著(zhù)升高。與對照組動(dòng)物相比，吸入煙霧后48小時(shí)，SI動(dòng)物肺組織裂解物免疫印跡中IL-6表達水平顯著(zhù)上調，進(jìn)一步驗證了BAL液和血漿樣本免疫分析中IL-6表達水平的增加。

結論：開(kāi)發(fā)了一種新型的大型動(dòng)物隔離煙霧吸入誘導的 ARDS 模型，該模型模擬人類(lèi) ARDS，并且沒(méi)有皮膚燒傷或腹內膿毒癥等混雜變量。該模型將有助于更好地了解煙霧吸入誘發(fā) ARDS 過(guò)程中涉及的病理生理機制，并有助于開(kāi)發(fā)新的治療策略。

原文出自：A novel large animal model of smoke inhalation-induced acute respiratory distress syndrome | SpringerLink

來(lái)源：Respiratory Research volume 22, Article number: 198 (2021) Published: 07 July 2021 作者：李曉菲譯