實(shí)驗助手—六大要素讓你告別RNA反轉錄失敗

RT Primer的佳選擇

通常RT primer可分為三類(lèi)：oligo dT，隨機引物以及基因特異性引物。Oligo dT引物之所以應用范圍更加廣泛，是因為可由此獲得mRNA的全長(cháng)拷貝。

然而如果mRNA長(cháng)度過(guò)長(cháng)>4kb，或者沒(méi)有polyA尾（原核mRNA或rRNA），就需要考慮使用隨機引物進(jìn)行RNA的反轉錄。隨機引物雖能長(cháng)基因的5’末端的轉錄，但并不能獲得整個(gè)基因全長(cháng)的cDNAs，且對RNA樣品質(zhì)量要求比較高，此時(shí)可用6-8個(gè)核酸聚合體來(lái)提高cDNAs的合成量。

而對于真核生物的qPCR，長(cháng)隨機引物和Oligo-dT引物的混合物似乎能給出一個(gè)漂亮的結果。針對此類(lèi)優(yōu)化混合引物，已有兩家公司的試劑盒或可助大家一臂之力：Qiagen QuantiTect Rev. Transcription Kit和BioRad iScript Kit。

第三個(gè)選擇就是基因特異性引物，僅擴增需要的cDNA，適用于目的序列已知的情況。通常在一步RT-PCR法中可使用此類(lèi)引物，因為該引物也可用作為PCR中的反向引物。

RNA的二級結構

若要獲取全長(cháng)RNA的反轉錄，那么RNA二級結構的問(wèn)題就不可忽略，因為反轉錄酶在遇到此類(lèi)結構后會(huì )終止反應或從模板上脫落下來(lái)。

也許你很難判斷RNA是否具有二級結構，但如果基因中GC含量較高，通常意味著(zhù)RNA很難被變性且不可能是單鏈，此時(shí)就需要在65℃ 5min對其進(jìn)行充分變性，以避免其對實(shí)驗結果的影響。

另外，還有一種方法可解決此問(wèn)題，即使用一種適溫度高于正常標準（37℃-42℃）的逆轉錄酶。比如來(lái)自L(fǎng)ife Technologies的Themoscript酶就常用于具有復雜結構RNA的逆轉錄。當然也存在一些即使在常規逆轉錄溫度（37℃-42℃）的條件下，也能跨過(guò)RNA二級結構的率逆轉錄酶，即使是針對富集GC序列的RNA也能得到很好的結果，如Qiagen公司的逆轉錄酶Omniscript和Sensiscript，以及Takara Bio公司的PrimeScirpt RT enzyme。

去除gDNA

RNA中存在的基因組DNA（gDNA）污染可能是終PCR反應中假陽(yáng)性結果出現的原因，目前已存在很多方法去除gDNA，比如通過(guò)DNAase對提取的RNA進(jìn)行預處理。

以上方法無(wú)可避免會(huì )造成RNA的蛋白污染，因而這里介紹一種可繞開(kāi)酶處理的方法，即針對RNA設計一種包含內含子或內含子-外顯子邊界的引物，如此DNA就不會(huì )產(chǎn)生擴增抑或即便擴增了其條帶大小也與cDNA不同。

但值得注意的是，使用該方法時(shí)基因中要沒(méi)有假基因存在，假基因（pseudogene）是插入到基因組中剪切mRNA的DNA拷貝，否則也會(huì )產(chǎn)生假陽(yáng)性結果。

而對于沒(méi)有內含子的原核RNA，gDNA的去除則更是基因表達準確測量的一個(gè)至關(guān)重要的因素。使用DNAase處理RNA是*的方法，Quantitect Rev.Transcription Kit中所包含的gDNA清除緩沖液就可在無(wú)需加熱或EDTA失活的條件下降解DNA。此外，具有g(shù)DNA Eraser（Takara Bio）的PrimeScript RT試劑盒也可去除gDNA，且能在不到20分鐘之內快速完成RNA的cDNA合成。

檢測RNA分子的完整性

毫無(wú)疑問(wèn)，RNA質(zhì)量對cDNA合成結果會(huì )產(chǎn)生重要的影響，而不同批次間RNA質(zhì)量差異也導致RT-PCR產(chǎn)生不同的結果。所以在進(jìn)行RT-PCR前，應該檢查RNA條帶的質(zhì)量，可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。通常完整的真核RNA應包括28S和18S RNA條帶，且較大的條帶的強度應是較小條帶的兩倍左右，另外兩個(gè)條帶強度大致相同也是可以的。

而另一種準確測量RNA質(zhì)量的方法是使用Agilent BioAnalzyer儀器，它可將RNA分子可視化并能在分析RNA完整數值（RNA Integrity Number，RIN）后給出一個(gè)質(zhì)量的量化標準。RIN為8-10，則表示RNA質(zhì)量非常好；當RIN值低于7，則說(shuō)明RNA可能有降解，可能會(huì )導致一些罕見(jiàn)信息的丟失等問(wèn)題。RNA定量

除了掌握RNA的完整性之外，準確評估產(chǎn)量也很重要。產(chǎn)量的準確性會(huì )受到以下因素的影響：測量?jì)x器的準確性、DNA的污染、鹽的污染以及降解程度。而為了準確測量產(chǎn)量，小編我更喜歡使用Nanodrop進(jìn)行UV定量。

該儀器不需要稀釋樣品，并且具有非常寬的測量RNA的范圍。以小編的經(jīng)驗，它可以準確讀取到10ng / ul。而傳統的紫外分光光度法應避免使用大容量的比色皿，因為這需要耗費大量的樣品。此法的缺點(diǎn)是也可在樣品中測量基因組DNA，如果從RNA提取過(guò)程殘留鹽或酚，則會(huì )增加吸光度，使得RNA的OD值變得更高。

而解決此問(wèn)題一個(gè)方法是使用熒光染料，Ribogreen是一種RNA特異性染料，可通過(guò)熒光來(lái)測量RNA產(chǎn)量?，F在，Nanodrop已經(jīng)具備檢測Ribogreen所發(fā)出熒光的功能。

兩步法或一步法RT-PCR

RT-PCR也分兩種類(lèi)型：一步法（One-step PCR）和兩步法（Two-steps PCR），具體操作見(jiàn)下圖。前者，RT反應和PCR擴增是在同一個(gè)反應管中進(jìn)行的；而后者，RT 反應與PCR擴增反應單獨進(jìn)行。

盡管這兩種方法都能得到終的結果，但是每種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)。選擇哪種方法取決于各種因素。如下總結它們的優(yōu)缺點(diǎn)。

一步RT-PCR消除了樣品轉移步驟，不僅消除了控制物污染的潛在來(lái)源，而且需要較少的準備和操作時(shí)間。又因一步RT-PCR中所使用的引物是基因特異性的，靈敏度高，常用于分析低表達水平基因。而其不足在于同一樣本中只有有限數量的目的基因被擴增，且需要在轉錄和擴增間尋找一個(gè)平衡。

所以當時(shí)間對實(shí)驗很重要時(shí)，一般采用一步法，如檢測RNA病毒，也適用于高通量分析。由于該法的檢測結果準確率高，因而在需要測量表達水平上的細微差異時(shí)，也可采用此方法。

而兩步RT-PCR可將大批量的RNA轉化為cDNA，然后儲存cDNA用于后續實(shí)驗，可檢測大量基因；在分別優(yōu)化RT和PCR步驟后，可更好地控制實(shí)驗過(guò)程；又因只有少量的轉錄本被用于PCR，則可能從RNA 分離到RT反應的抑制劑（如乙醇、酚及胍鹽等）都被稀釋了。

但是兩步RT-PCR更耗費時(shí)間，且帶來(lái)污染的可能性更高；RT過(guò)程應以相同效率反轉錄RNA，否則會(huì )影響qPCR的啟動(dòng)效率，進(jìn)而帶來(lái)不同的實(shí)驗結果，因此對于每個(gè)RT反應應使用相同的條件。

如果你需要對同一樣本的多個(gè)目標進(jìn)行分析時(shí)，可選擇兩步RT-PCR。另外，當RNA的存儲是個(gè)問(wèn)題時(shí),好是進(jìn)行兩步RT-PCR，因為cDNA在-20℃是穩定的。